楊茂君實驗室全體成員合影

楊茂君團隊發表在《細胞》雜志網站的照片

豬源呼吸鏈超級復合物中等分辨率三維結構(局部)

豬源超級復合物的高分辨率結構(局部)

瘧原蟲Ndh2二聚體的高分辨率三維結構(局部)

人源呼吸鏈超超級復合物的結構模型(局部)

從基質側觀察的ATP合成酶四聚體的結構(局部)

楊茂君教授很滿意自己的微信頭像，作為清華大學生命科學學院教授，做線粒體呼吸鏈研究十余年，他把一張滿是中國元素“飛龍”的圖片做成頭像，圖畫中奔騰的“二龍”：一條是年畫中威武的“中國龍”，另一條“龍”由呼吸鏈中蛋白質機器的三維圖“幻化”而成(左圖)。

在接受科技日報記者采訪時，楊茂君表示，這張圖是發表在國際頂級期刊《細胞》雜志網站首頁的照片，它代表著所在團隊在生命科學領域取得的一項突破性成果。

呼吸，是生命的體征和原動力，人無時無刻不在呼吸，呼吸作用主要由位于線粒體內膜上的呼吸鏈超級復合物完成，對線粒體呼吸鏈的研究一直都是生命科學領域的熱點之一。1978年Peter D.Mitchell因提出線粒體呼吸鏈的化學滲透假說，1997年John E.Walker因闡明三磷酸腺苷(ATP)合成酶的三維結構獲得諾貝爾化學獎;日前，William G.Kaelin等科學家因發現了氧氣感知通路(生命體對缺氧和富氧做出不同反應的分子機制)獲得了2019年諾貝爾生理學或醫學獎。

早在2008年剛回國組建實驗室時，楊茂君教授就認定了線粒體呼吸鏈這個研究方向。當時，處于呼吸鏈上游的超級復合物的結構及功能的研究，在我國還相對比較落后，面對這塊難啃的“骨頭”，他偶爾也會感嘆“前路漫漫”。

經過十年如一日的潛心研究，楊茂君團隊在這條探索之路上終于取得了一系列成果：攻克了哺乳動物線粒體呼吸鏈超級復合物的原子分辨率結構這一難題;首次從體外培養的人源細胞中分離、純化出高純度的呼吸鏈蛋白復合物，并且首次發現并解析了人源超超級復合物I2III2IV2的高分辨率三維結構。相關研究成果“線粒體呼吸鏈蛋白的結構與功能研究”獲得了2018年度北京市科學技術獎二等獎。

首次解析呼吸鏈超超級復合物高分辨率結構

什么是呼吸鏈呢?

線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，是細胞的“動力車間”，細胞生命活動所需的能量，大約95%來自線粒體。線粒體里面有一層褶皺很多的內膜，內膜上有生產能量的“機器”——蛋白質，這些蛋白質在內膜上完成氧氣、電子、質子等物質的“搬運”“安裝”等工作，這條產生能量的“流水線”被稱為呼吸鏈。楊茂君教授團隊所做的，正是將這些“機器”的“配件”一點點拆解開來，并為其畫出精細的結構。

想要研究呼吸鏈超級復合物的功能，首先要能夠看清它的“模樣”。前人的研究表明，呼吸作用由位于線粒體內膜上的4種呼吸鏈蛋白復合物分步完成。這四種蛋白復合物分別為復合物I(NADH脫氫酶)、復合物II(琥珀酸脫氫酶)、復合物III(細胞色素c還原酶)和復合物IV(細胞色素c氧化酶)。

“復合物并不是單獨存在，而是以不同的形式組合形成超級復合物，由于目前很多復雜的大分子物質難以獲得晶體，X射線晶體學成像便無法獲得其高分辨率結構，因此需要借助最新科技成果——冷凍電鏡技術來幫忙。”楊茂君教授說道，“通過篩選、添加大量活性小分子化合物，我們開發并優化了蛋白純化新方法，最終獲得了結構穩定、均一性好、純度較高的豬源線粒體超級復合物，借助單顆粒冷凍電鏡技術，解析了超級復合物的結構，整體分辨率達到3.6到4.0埃，可以觀測到蛋白質亞基之間復雜而細致的相互作用，并利用此方法獲得了人源呼吸鏈超超級復合物(I2III2IV2，由2個復合物I、1個復合物III的二聚體、2個復合物IV和2個細胞色素c蛋白組成)的高分辨率三維結構。”這是當時世界上所解析的最大、也是最復雜的膜蛋白超級復合物結構，為人類深入理解哺乳動物呼吸鏈復合物的組織形式、分子機理以及治療細胞呼吸相關的疾病提供了重要的結構基礎。相關研究成果已發表在國際頂級期刊《自然》《細胞》上。

基于獲得的高分辨率結構，楊茂君教授提出了全新的電子傳遞機制，新提出的電子傳遞模型考慮到了超級復合物的存在形式，整個過程中不會產生超氧自由基，并且具有更高的電子傳遞效率，從能量轉換的角度來說對能量的利用更加高效，從結構上考慮也更加合理。目前，這一理論還處于假設階段，需要后續更加精細的生物化學實驗對其加以驗證。

如何利用解析出的蛋白質結構研發靶向藥物，治療呼吸鏈異常引起的疾病，讓科學研究為人類的健康服務也是目前研究的重點。楊茂君教授告訴記者：“由于II型復合物I只存在于低等生物中，所以它被認為是一種很好的對抗病原體的特異性靶標分子。例如，瘧疾是受到全球關注的重要公共衛生問題之一，通過篩選，科學家發現存在兩種化合物可以與靶蛋白共結晶，而且對細胞毒性較低。其與青蒿素有協同抗瘧疾作用，因此具有與青蒿素聯合用藥發展新的瘧疾治療方法的潛能。該工作為抗瘧疾藥物研發提供了重要信息，依據該信息的抗瘧疾藥物也正在研發之中。”

科學研究要不唯書、不唯上、只唯實

認真觀察、大膽假設、小心求證是獲得原創性突破成果的“三大法寶”。論文發表后，楊茂君教授時常端詳這組復合物，復合物I、III、IV像樂高玩具的組件一樣被拼插在一起。

“我發現這里空著。”楊茂君教授一邊指一邊對記者說，復合物III伸出一只“手臂”，“經過億萬年的進化，生物體不可能讓另一邊這樣浪費著，肯定還有沒被發現的結構”。

楊茂君教授富有創意地用“中國龍”圖案來代替未被揭秘的對稱面，這正是發表在《細胞》上的論文配圖的由來。

楊茂君教授相信這一研究可以更進一步，但是線索在哪兒?

“對稱才是美的，伸出的這邊很可能結合著其他的復合物。”楊茂君教授決定重新純化復合物IV，“拿到密度圖之后，我仔細分析了各個亞基的情況，結果發現13個亞基都吻合匹配，只是在原來認為結合另一個復合物IV形成二聚體的界面上出現一團‘不明物體’。通過建立模型，進行匹配，發現那團‘不明物體’是亞基NDUFA4。在以往純化復合物IV時，亞基NDUFA4由于超強去垢劑的加入而無法穩定結合。”

至此，復合物IV的謎底終于被揭開。“正確的蛋白質結構，能夠讓我們更加清晰地了解電子傳遞的路徑。在復合物IV的反應中心，氧氣生成了水，同時另一部分質子(H+)被直接泵入線粒體膜間隙中留作他用。”楊茂君說，“在漫長的研究過程中，我們每天面對的不是成功的喜悅，而是各種失敗，但正是在失敗的基礎上逐漸發現真相的過程，才最讓人興奮。”

科學家要為人類健康和未來發展思考

對線粒體呼吸作用的研究不僅具有重要的科學意義，而且有助于攻克多種嚴重的綜合性疾病。

“人類線粒體呼吸鏈系統異常會導致多種疾病，例如，阿爾茨海默綜合征、帕金森綜合征、多發性硬化等，我們的研究成果為這些疾病提供了一種治療的可能性，希望我們的研究最終能夠被轉化成治病救人的藥物。”楊茂君教授對記者說道，越深入地了解蛋白質的精細結構，越能夠參透生命體的運轉。“通過研究，我們可以明確知道哪個原子出了問題，并設計藥物有的放矢地干預疾病，以達到治療效果。”

研究團隊目前正在對已經上市的1400多種藥物進行分析，發現有56種藥物的作用靶點在呼吸鏈上。

“例如，呋塞米能促進細胞呼吸，提高氧氣利用效率，是目前最有效的抗高原反應藥物，其作用靶點正是在呼吸鏈上。病人在服用有些藥物后會產生心悸、無力等副作用，這些發現可以幫助科學家改進藥物，以消減其副作用。”楊茂君教授表示。

在楊茂君教授內心深處，有一個終極夢想：通過科學研究，實現人體溫度的調控，以延長人的壽命。“假如某人患上醫學領域某種目前還不能被治愈的疾病，可以選擇把他的體溫降下來，維持基礎代謝，讓他進入睡眠狀態。過20年，這個病能治了，再讓他蘇醒，接受更好的治療。”他對記者說道。

之所以有這樣的終極夢想，楊茂君教授表示，并不是天馬行空，人體體溫熱量主要來源于線粒體，實現這個夢想的突破口就在線粒體的研究上。

呼吸是機體最基本的生命活動，最為平常卻又十分神秘，揭開呼吸鏈超級復合物的“廬山真面目”，探索自身生命活動的規律，是人類醫藥健康發展歷史上一個永恒的話題。

關鍵詞： 呼吸鏈 超級復合物 科學技術